故事發生在昆蟲世界中，蜘蛛擔任警察維護秩序。經驗豐富的偵探孫神探（維森特·希爾配音）在押送宿敵黑寡婦（伊恩·巴切洛配音）前往舊金山接受審判的航班上，遭遇神秘謀殺案。死者體內的特殊毒液顯示此案關聯著跨越人蟲兩界的龐大陰謀，而黑寡婦在飛行途中離奇失蹤更令案情復雜化。隨著調查深入，孫神探發現有人企圖利用生物武器引發跨物種戰爭，在搭檔伊戈爾（錢信伊配音）與昆蟲專家艾米莉博士的協助下，他必須搶在時限內破解毒液來源。當真相揭露黑寡婦實為被迫參與陰謀的受害者時，孫神探選擇與其合作，在飛機墜毀前的關鍵時刻成功摧毀生物武器實驗室。這場危機最終促成人蟲兩界建立正式協作機制，而孫神探也兌現承諾讓黑寡婦獲得新生機會。